2021年1月15日上午11:30，中国细胞生物学学会细胞死亡分会开展线上学术交流系列讲座第11期，本期讲座通过“腾讯会议”进行实时直播，主讲人为艾有为博士，来自北京生命科学研究所王晓东实验室的博士后。本期讲座由中国科学院生物物理研究所研究组长丁璟珒博士和西湖大学助理教授邹贻龙博士主持，特邀暨南大学何蓉蓉教授和中国科学院上海营养与健康研究所尹慧勇教授作为点评嘉宾。共同探讨POR和CYB5R1作为铁死亡正向调控因子，如何介导磷脂过氧化过程的分子机制。


 

铁死亡（ferroptosis）是一类由铁离子依赖的多不饱和脂肪酸磷脂过氧化驱动的细胞死亡模式。铁死亡最早由Brent R. Stockwell 教授于2012年发现并命名。铁死亡被发现在多种器官，包括肾和大脑的损伤或退行性疾病中发挥作用。与此同时，在多种癌症中，铁死亡通路被认为是非常有潜力的可靶向通路。
 

目前铁死亡研究领域有两个关键问题亟待更多的机制研究: 1.铁死亡通路中的正向调控因子的鉴定，可以为多种疾病包括癌症提供靶点; 2.多不饱和脂肪酸磷脂的过氧化发生机制。在铁死亡研究领域，大量研究对细胞的抗氧化系统进行了报导，关键调控因子包括GPX4,FSP1,xCT, GCH1等。其中GPX4(谷胱甘肽过氧化酶4)以GSH(谷胱甘肽)为还原剂，将脂质过氧化物还原为对应的醇，从而保护细胞免受脂质过氧化损伤。但是对于引发细胞铁死亡的脂质过氧化过程的分子机制还缺乏研究。先前研究指向脂氧合酶（lipoxygenases）是多不饱和脂肪酸磷脂过氧化的催化酶，但是最近的研究却发现lipoxygenases的小分子抑制剂具有捕获自由基的活性(radical-trapping activity)，可能导致了‘抑制lipoxygenases的活性可以抑制铁死亡’的错误结论。与此同时，lipoxygenases在大多数可以发生铁死亡的癌细胞中表达甚少，因此对介导铁死亡过程中磷脂过氧化的真正催化酶亟需更深入研究。
 

艾博士的研究中，偶然发现了一个蛋白质二硫键异构酶抑制剂，PACMA31，能够诱导细胞死亡，并且通过化学偶联的方法鉴定了其直接靶向蛋白为GPX4。通过化合物库的筛选，艾博士进一步发现了一个能与PACMA31协同促进铁死亡的小分子，Regorafenib。Regorafenib能通过调节细胞内的胱氨酸水平诱发细胞的铁死亡。以这两个小分子抑制剂诱导的细胞铁死亡系统为基础，作者开展了全基因组范围内的CRISPR/Cas9筛选，以无偏向性的手段研究铁死亡过程中的正向调控因子。在作者的筛选中，发现了ACSL4, Cytochrome P450 Oxidoreductase (POR)等蛋白，其中ACSL4是领域内已知的通过调节介导铁死亡的底物即多不饱和脂肪酸磷脂（PUFA-PL）的水平来间接影响细胞对铁死亡诱导剂的敏感性，证明了本次筛选的有效行。与此同时，在稍早的另一篇文章(Zou et al., Nature Chemical Biology 2020)中，邹贻龙博士也独立的鉴定并报导了POR在细胞内行使铁死亡正向调控因子的作用，并且将POR的生化作用锁定在了磷脂过氧化这一步骤。由于POR的敲除并不能完全消除细胞对于铁死亡诱导剂的敏感性，作者猜测除了POR，细胞中还有其他蛋白也会正向调控细胞铁死亡的敏感性。经过小范围的shRNA screen，作者发现了另一个蛋白，CYB5R1，同样能正向调控细胞的铁死亡，虽然其对于铁死亡的贡献比POR略弱。在正常情况下，POR和CYB5R1分别将NADPH和NADH的电子传递给下游CYP450等蛋白。在艾博士的工作中，通过一系列生物化学实验，提出了POR和CYB5R1通过以电子传递功能依赖的方式，将泄漏的电子传递给溶解的氧气，导致H₂O₂的积累的作用方式。艾博士进一步推测，H₂O₂在活性亚铁离子(Fe²⁺)存在的情况下，发生芬顿反应(Fenton Chemistry)产生羟基自由基，活跃的羟基自由基进而攻击不饱和脂肪酸长链双键间(1,4-diene)的氢原子，引发脂质脱氢和过氧化链式反应, 并最终导致细胞铁死亡。此外，艾博士以表达纯化的POR，CYB5R1蛋白和liposome在体外重建了POR，CYB5R1催化脂质过氧化导致liposome破裂的生化过程, 为铁死亡过程中细胞膜过氧化损伤的提供了独特的理论依据。
 

艾博士精彩的报告，引起了大家热烈的讨论，大家主要讨论的问题包括了：在生理条件下H₂O₂是如何能将电子传递到质膜的多不饱和脂肪酸链上，进而引发脂质的过氧化，以及H₂O₂ 在活体细胞中是否真正直接参与到铁死亡的诱发过程中；是否还存在除H₂O₂外的其他亲脂性的自由基也参与了起始多不饱和脂肪酸磷脂的过氧化过程；如果H₂O₂是引发铁死亡的主要因子，为什么细胞内其他产生H₂O₂的蛋白没有在筛选中鉴定出来；另外，其它几项研究也提出直接改变细胞培养体系的H₂O₂水平，并不能影响细胞对铁死亡的敏感性和为什么H₂O₂ 过量富集引起的细胞死亡并不能被铁死亡抑制剂所rescue等问题。一个小时的深入讨论和交流，给我们带来了更多的思考和理解，为未来的研究指明了方向。本次学术会议在邹贻龙博士号召更多领域的专家学者加入到攻克铁死亡的机制和药物研发瓶颈的努力中而圆满结束。

 

  铁 · 死 · 亡 · 研 · 究 · 工 · 具  

Ferroptosis Antibody Sampler Kit #29650

产品包括	数量	应用	反应性
GPX4 Antibody 52455	20 µl	WB	H M Mk
NCOA4 (E8H8Z) Rabbit mAb 66849	20 µl	WB IP	H
KEAP1 (D6B12) Rabbit mAb 8047	20 µl	WB IF	H M R
NRF2 (D1Z9C) XP® Rabbit mAb 12721	20 µl	WB IP F ChIP	H M Mk
4F2hc/CD98 (D3F9D) XP® Rabbit mAb 47213	20 µl	WB IHC IF F	H
FTH1 (D1D4) Rabbit mAb 4393	20 µl	WB IP	H M R Mk
xCT/SLC7A11 (D2M7A) Rabbit mAb 12691	20 µl	WB IP	H
DMT1/SLC11A2 (D3V8G) Rabbit mAb 15083	20 µl	WB IP	H
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 7074	100 µl	WB

 

Redox Homeostasis and Signaling Antibody Sampler Kit #16815

产品包括	数量	应用	反应性
GPX1 (C8C4) Rabbit mAb 3286	20 µl	WB	H
GPX4 Antibody 52455	20 µl	WB	H M Mk
Thioredoxin 1 (C63C6) Rabbit mAb 2429	20 µl	WB IHC	H M R
Thioredoxin 2 (D1C9L) Rabbit mAb 14907	20 µl	WB	H M R Hm Mk
TRXR1 (D1T3D) Rabbit mAb 15140	20 µl	WB IHC	H M R Hm Mk
TXNIP (D5F3E) Rabbit mAb 14715	20 µl	WB IP	H M R Mk
Prdx1 (D5G12) Rabbit mAb 8499	20 µl	WB	H M R Mk
Phospho-Prdx1 (Tyr194) (D1T9C) Rabbit mAb 14041	20 µl	WB IP	H
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 7074	100 µl	WB

 

检测胞内还原型谷胱甘肽：Cellular Glutathione Detection Assay Kit #13859

组分包括	数量（计数）
Reduced Glutathione Standard	1 x 1 次
Glutathione-S-Transferase	1 x 1 次
Tris Assay Buffer	1 x 25 ml
Digitonin Lysis Buffer	1 x 11 ml
Monochlorobimane	1 x 1 次

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

 

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