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一个失败的WB会浪费多少？

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一个失败的WB会浪费多少？

790 人阅读发布时间：2020-06-28 15:50

很多时候，统计实验室花费可不像研究我们最喜欢的信号通路那般愉快。显然，研究经费来之不易，在选择免疫印迹（Western Blot，WB）的试剂时，我们真该好好考虑考虑。

很明确的是，一抗的质量是我们首先要保证的，因为整个实验的成功高度依赖于抗体的可靠性、特异性和灵敏度。如果抗体表现不如我们预期，实验就会失败……这时，一个失败的WB实验的花费可能远远超过我们的想象。

抗体供应商的抗体价格、抗体的验证程度、支持数据的质量这三个方面差异很大。大型公司经常自豪于自己的产品种类多，但单个抗体的可靠性，特异性，敏感性可能不能满足我们的期望。相反，我们可以选择坚持验证每一支一抗的公司，而且他们也愿意与客户分享数据。不合适的抗体可能缺乏特异性，导致假阳性结果，或不足够敏感，导致假阴性结果。更糟糕的是，如果没有适当的实验对照，一个抗体的失败可能不很明显，但在错误结果的基础上继续开展项目就会造成极大的损失。

2018年，《科学报告》上发表了一篇关于严格测试 9 款市售抗体的文章，结果发现仅一种抗体 NLRP3 (D4D8T) Rabbit mAb #15101（来自 Cell Signaling Technology [CST]）符合所有验证标准。

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通过蛋白印迹实验验证市售抗NLRP3 抗体的特异性。RAW 264.7细胞用 LPS (10 ng/mL) 诱导 6 小时，并与未经载体处理的细胞进行对比。THP-1 巨噬细胞用 LPS (10 μg/mL) 和 ATP (5 mM) 诱导3 小时，并与载体对照 THP-1 巨噬细胞进行对比。将 50 μg 总蛋白上样到凝胶上，并用抗 NLRP3 抗体进行免疫印迹，分子量预计约为 118 kDa。

新闻图片3

使用小鼠和人阳性对照物（包括小鼠脾脏组织、小鼠 RAW 264.7 和人 THP-1 巨噬细胞细胞系）对9 款市售抗 NLRP3 抗体的特异性进行了测试。通过检测作为阴性对照的 NLRP3 敲除型小鼠脾脏组织中的蛋白表达，来验证抗体特异性。

细品，从实验代价来看，这个测评结果很可怕。从样品制备到免疫印迹，WB是费时和昂贵的。制备样品的成本也要加上去，特别是如果使用组织或原代培养的细胞时。例如，实验动物样本的成本很高，因为动物饲养也不便宜。不仅需要几周的时间以获得样本，而且还有WB实验的实际时间。这意味着样品的采集会花费数千甚至数万元，需要数周，甚至数月的时间。如果这一切的努力后，未验证的抗体导致WB实验失败，这将是一个悲剧……

一个失败的WB迫使我们去进行大量的问题排除。这意味着我们要花时间和金钱，优化实验条件，例如通过滴定抗体，所以我们必须在其他实验花更少的时间。同时，我们的宝贵资金也花了。由于这些原因，最重要的是使用一种抗体，可以信任地为我们工作，第一次和每一次。为了确保这一点，我们使用的抗体应充分验证过，有一个已知的最佳稀释度。

为了减少失败的风险，你也可以验证你的抗体以确保它符合下列要求：

1. 在对照细胞/组织里，在预期的分子量处有一条清晰的条带

2. 特异性由以下一个或多个处理来确认：

· 激活剂或抑制剂处理

· 阳性和阴性细胞或组织

· 对磷酸化抗体做磷酸酶处理

· 用siRNA或其他手段敲低，或敲除的小鼠模型

· 用滴定法测定最佳稀释度

以上工作意味着在正式实验前你就需要运行多个印迹、还购买额外的试剂，这些也是不便宜的。因此，我们真的需要从符合以上验证标准且可分享数据给我们的供应商处购买抗体。这些已经被严格验证了的抗体可以保证我们的WB实验成功机率最大化。最终，这有助于我们获得可靠的数据用于发表，使我们的项目进展更快，成本更低。

总而言之，买一个质量差的抗体可能让我们花费很多，不管是时间还是金钱。现在就买一个充分验证了的、而且可以信任的抗体吧！

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