摘要： 本文总结了各神经元 Marker 的特点及染色过程中的要点及注意事项。


说起神经元，脑海里有没有出现闪电的场景？
 
乌云下的那道转瞬即逝的闪电看上去与神经元形似，没错！是形似而神不同。从皮囊上看似很像，但灵魂却完全不同。神经元是神经系统的结构与功能单位之一。它占了神经系统约 10%， 由树突、轴突、髓鞘、细胞核组成（图 1）。神经元具有感受刺激和传导兴奋的功能。树突多呈树状分支，它可接受刺激并将冲动传向胞体；轴突呈细索状，末端常有分支，称轴突终末，轴突将冲动从胞体传向终末。通常一个神经元有一个至多个树突，但轴突只有一条。
神经元一方面接受来自其它特定细胞的信息输入，另一方面其细长的轴突又会定向投射到靶细胞。他们的联络方式又会随脑的不同功能变化出现调整，共同完成脑的各种高级指令。

神经元是一种高度分化的细胞，成熟的神经元主要来源于神经干细胞的分化，神经干细胞在脑源性神经营养因子、神经营养素诱导因子的刺激下进一步分化成神经元前体细胞，最终又分化成神经元。这一过程也可以通过转基因的方法，如在干细胞中转染相应的转录因子 Sox2 、Wnt、Nkx2.1 可分化出相应的神经元。最常见的成熟神经元 Marker 是β3-Tubulin、Neurofilament、 NeuroN 。β3-Tubulin 和 Neurofilament 分别属于细胞骨架的微管蛋白和中间丝蛋白，NeuroN 属于神经元细胞核蛋白。下图是各成熟神经元 Marker 染色结果（图 2）。
看了上面的图，有没有惊叹「怎么可以染出这么逆天的美图？」「怎么做到的?」

掌握了以下几点，就不难了！

1. 深入了解并确定要染色的神经元
2. 找到针对样本可做染色的抗体
3. 制备新鲜高质量的样本
4. 参考抗体公司给出的染色步骤

首先，需要我们确定染哪个神经元 Marker，只有对需要染色的 Marker 有一个深入的认识，才知道 Marker 的形态和定位。分析染色结果时才知道真阳性是什么。因此，待染色的神经元 Marker 的特征要了解透彻。除了上文提到的最常用的β3-Tubulin、Neurofilament、 NeuroN，这里，我总结了未成熟和成熟神经元 Marker 的特征，干货大放送，详见表 1、2。

表 1：未成熟神经元
 

神经元 Marker	背景介绍
Doublecortin	双皮质素是与微管相关的蛋白，可稳定微管并使其成束。保守的双皮质素结构域介导与微管相互作用，并且，有趣的是，大部分错义突变簇集在这个结构域中。激酶 JNK、CDK5 和 PKA  磷酸化双皮质素。JNK 磷酸化 Thr321、Thr331 和 Ser334, 而 PKA 磷酸化 Ser47 并且 CDK5 磷酸化 Ser297。Ser297 磷酸化的双皮质素对微管的亲和力降低。另外， Ser297 的突变会导致迁移缺陷。双皮质素的突变造成无脑回症（光滑脑），这是一种以癫痫和精神发育迟滞为特征的神经元迁移异常症状。
TBR1	T 盒脑蛋白 1 (TBR1)  是脊椎动物胚胎发育过程中的一个重要转录因子。作为 T 盒转录因子家族的一员，TBR1  在有丝分裂后期谷氨酸能投射神经元中表达。在皮质神经发生过程中，转录因子 Pax6、TBR2 和  TBR1 的顺序表达会调节投射神经元分化中的分离步骤。TBR1 在发育皮质的层 6 富集。在 TBR1 缺失的情况下，TBR1 突变体在前脑皮层和层 6 分化方面存在严重缺陷，表明 TBR1 可调控有丝分裂后期皮质神经元的区域和分层同一性。因此，TBR1  表达可用作有丝分裂后期谷氨酸能神经元和皮质分层特异性的一个标记。
NeuroD	NeuroD 是碱性螺旋 - 环 - 螺旋 (bHLH)  转录因子家族的一员。这些蛋白与 E 蛋白共同形成异二聚体，可结合典型的 E 盒序列 CANNTG。神经元活性会引起  CaMKII 介导 NeuroD 在 Ser336 位点的磷酸化，这是树突形成和生长所必需的。NeuroD  还在 Ser274 位点被磷酸化，其结果根据具体情况而不同，因为 Erk 磷酸化会刺激胰腺 β 细胞中的 NeuroD 活性，而 GSK-3β  磷酸化则会抑制神经元中的 NeuroD。NeuroD 对胰腺和发育性神经系统至关重要，在内耳和哺乳动物视网膜的发育过程中起着很大的作用。缺乏  NeuroD 的小鼠会患严重的糖尿病，并且可能会在出生后不久因 β 细胞分化缺陷而死亡。脑细胞内缺乏 NeuroD 会导致严重的发育缺陷。人基因突变与  I 型糖尿病和年轻成年发病的糖尿病等多种类型的糖尿病有关。

表 2：成熟神经元
 

神经元 Marker	背景介绍
β3-Tubulin	细胞骨架由三种类型的细胞质基质纤维组成：微管、微丝（肌动蛋白纤丝）和中间纤丝。球形微管蛋白亚基包含微管建筑块，由  α/β-tubulin 异源二聚体形成所有真核细胞的 tubulin 亚基。需要 γ-tubulin  使微管蛋白亚基聚合成核，从而形成微管聚合物。许多细胞运动是通过微管动力介导的，包括纤毛和鞭毛摆动、膜囊泡的核质转运、在减数分裂 / 有丝分裂期间染色体对齐和神经轴突迁移。这些运动是由于竞争性微管聚合作用和解聚作用或通过微管动力蛋白的运动产生的。    β3-tubulin (TUBB3) 是六个 β-tubulin  同工型之一，在胎儿发育和产后发育（轴突导向和成熟）中高度表达。其表达水平在成人中枢神经系统 (CNS) 中降低，但在周围神经系统 (PNS)  中保持高水平表达。在 β3-tubulin 中富集的微管比由其他 β-tubulin 同工型构成的微管更有活力。研究表明，β3-tubulin 基因  TUBB3 的突变，会导致动眼缺陷和其他神经系统疾病。另外，β3-tubulin 在肿瘤细胞中出现，但不在正常分化的胶质细胞中出现。因此，β3-tubulin 是一个主要的神经元标记物。
NeuN	神经元细胞核  (NeuN, Fox-3, RBFOX3) 是一种在多数中枢和周围神经系统的有丝分裂后神经元中表达的胞核蛋白。NeuN 在浦肯野细胞、交感神经节细胞、Cajal-Retzius 细胞、INL  视网膜细胞、下橄榄核或齿胞核神经元中均未检测到。这种神经元蛋白最初是使用一种称为 NeuN 的单克隆抗体通过免疫细胞化学反应被鉴定。通过 MS  分析，NeuN 被鉴定为 Fox-3 基因产物。Fox-3 包含一个 RNA 识别基序，并作为一种剪切调节分子发挥作用 。Fox-3 调节 NumB  的选择性剪切，进而促进发育过程中的神经元分化 。
Neurofilament	细胞骨架包含 3  种类型的细胞溶质纤维：肌动蛋白微丝、中间纤丝和微管。神经丝是神经元的主要中间纤丝，包括轻 (NFL) 亚基、中  (NFM) 亚基和重 (NFH) 亚基。与其它中间纤丝蛋白的结构类似，神经丝也具有一个球状的氨基末端头、一个中央  α- 螺旋杆结构域和一个羧基末端尾区。它的前体纤维由一种异型四聚体单位（NFL-NFM 和 NFL-NFH）构成，八条这样的前体纤维组成一个典型的 10  nm 的中间纤丝。神经丝在轴突径向生长和轴突口径中发挥作用，微管参与轴突伸长。PKA 磷酸化 NFL 和 NFM 的头端结构域，并抑制神经丝的聚集。研究表明，神经丝的聚集在许多人神经系统疾病中被发现，包括帕金森病（与 Lewy 小体中  α- 突触核蛋白有关）、阿尔茨海默病、腓骨肌萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症 (ALS)。
MAP2	微管结合蛋白 2  (MAP2) 是一种神经元磷蛋白，可调节微管的结构和稳定性、神经元形态形成、细胞骨架动力学以及轴突和树突细胞中的细胞器转运。神经元中有多种 MAP2 同工型表达，包括高分子量 MAP2A 和 MAP2B（280 和 270 kda）和低分子量  MAP2C 和 MAP2D（70 和 75 kda。MAP2 磷酸化可调节与细胞骨架的结合，并且受发育调控。GSK-3 和 p44/42 MAP 激酶在  Ser136、Thr1620 和 Thr1623 位点磷酸化 MAP2。GSK-3 在 Thr1620/1623 的磷酸化会抑制 MAP2  与微管的结合以及微管稳定性。
UCHL1	蛋白泛素化和去泛素化是由泛素化酶 (UBE) 和去泛素化酶  (DUB) 催化的可逆过程。DUB 分为 5 个亚家族：USP、UCH、OTU、MJD 和  JAMM。UCHL1、UCHL3、UCHL5/UCH37 和 BRCA-1 结合蛋白 - 1 (BAP1) 属于 DUB 的泛素羧基末端水解酶 (UCH)  家族，它们均包含一个大约由 230 个氨基酸组成的保守催化 UCH 结构域。UCHL5 和 BAP1 具有独特的羧基末端延伸尾区。UCHL1 在神经元组织和睾丸中高度表达，而 UCHL3  表达分布则更加广泛。尽管 UCHL1 和 UCHL3 是最紧密相关的 UCH 家族成员，具有大约 53% 的相似性，但它们的生化特性却不同， UCHL1  结合单泛素，而 UCHL3 则对泛素 (Ub) 和泛素样分子 NEDD8 具有双重特异性。    UCHL1 (PGP 9.5/PARK5) 可作为去泛素化酶和单泛素稳定剂发挥作用。体外研究证明，UCHL1 能够水解泛素羧基末端甘氨酸和靶标蛋白赖氨酸  ε- 氨基组之间的异肽键。UCHL1 还参与促泛素和核糖体蛋白的共翻译加工过程，二者被翻译作为泛素融合蛋白。 缺乏 UCHL1 的小鼠会出现痉挛，表明  UCHL1 活性是正常神经肌肉接合结构和功能所必需的。研究表明，UCHL1  在多种人恶性肿瘤中的表达缺失，如前列腺癌、结直肠癌、肾癌和乳腺癌。研究人员发现，UCHL1 在乳腺癌中表达缺失是由 UCHL1  基因启动子的超甲基化所致。UCHL1 表达缺失与人肿瘤发生有关，而 UCHL1 突变则与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关。
Enolase-2	Enolase 是参与  2 - 磷酸甘油酸盐转换成磷酸烯醇丙|酮酸盐的糖酵解酶。哺乳动物的 enolase 有三个亚基：α、β 和 γ，可以形成同型二聚体和异二聚体。γ  enolase 的同型二聚体具有神经元特异性。研究已显示，神经元特异性的 enolase-2 在成神经细胞瘤 和小细胞肺癌中的水平有所提高。
Tau	Tau  是一种异源微管相关蛋白，可促进并稳定微管组装，尤其是在轴突中。现已发现 6  种同工型，它们有不同的氨基末端插入点，并且在羧基末端周围有不同数量的串联重复序列，tau 在大约 25 个位点被 Erk、GSK-3 和 CDK5  高度磷酸化。磷酸化会减弱 tau 结合微管的能力。神经元纤维缠结是阿尔茨海默病的一个主要标志；这些缠结是由高度磷酸化的  tau 构成的成对螺旋纤丝束。尤其是，GSK-3 或 CDK5 磷酸化 Ser396  会使微管变得不稳定。此外，研究表明，在许多其它神经退行性疾病细胞中会发现 tau 内含物，统称  tau 病变。
Thy1/CD90	Thy1/CD90  细胞表面抗原是一种 GPI 锚定、受发育调控的蛋白，它参与能介导神经突增生、T 细胞激活、肿瘤抑制、凋亡及纤维化的信号转导级联。Thy1/CD90  在成体神经元表面高表达，被认为在调节黏附与迁移活动（如神经突延伸）的过程中起作用。Thy1/CD90  mRNA 和蛋白表达下降与上皮性卵巢癌的发生有关联，表明可能具有潜在的人卵巢癌抑癌基因作用。研究表明，Thy1/CD90  敲除小鼠会出现皮肤免疫应答受损，及视网膜发育异常。Thy1/CD90 在某些疾病状态（如肺纤维化）受表观遗传调节，或出现失调。Thy1/CD90  启动子的潜在可逆过度甲基化可能会为这种疾病提供新的治疗选择。

其次，需要找寻可靠的抗体。一支抗体，可以做 WB, 不一定可以做免疫荧光；可以做细胞的免疫荧光，不一定可以做组织的免疫荧光。关于抗体的这一特性，可以完全参考抗体说明书。在 CST 的官网及产品说明书上，写有 IF-IC 的表示可以做细胞的免疫荧光；写有 IF-F 的表示可以做冰冻切片的免疫荧光。如果抗体的应用栏没有写 IF, 则表示该抗体不能做 IF 或者做 IF 的效果不好，请谨慎选择！小编已经帮您列好可以做神经元染色的抗体，请参考下表。
 

神经元 Marker	产品编号	产品名称	应用	反应性
Doublecortin	#14802	Doublecortin (A8L1U) Rabbit mAb	IF-F	M
TBR1	#49661	TBR1 (D6C6X) Rabbit mAb	IHC-P	H M R
	#45664	TBR1 (D6C6X) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)	IF-F	M
	#66626	TBR1 (D6C6X) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 594 Conjugate)	IF-F	M
	#32518	TBR1 (D6C6X) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)	IF-F	M
NeuroD	#4373	NeuroD (D35G2) Rabbit mAb	WB,IP,ChIP	H, M, R
	#7019	NeuroD (D90G12) Rabbit mAb	WB,IP	H
	#2833	NeuroD Antibody	WB,IP	H
MAP2	#8707	MAP2 (D5G1) XP® Rabbit mAb	WB,IP,IF-F	M, R
	#4542	MAP2 Antibody	WB,IF-F	H, M, R, Mk
	#4541	Phospho-MAP2 (Ser136) Antibody	WB,IF-F	H, R, Mk
	#4544	Phospho-MAP2 (Thr1620/1623) Antibody	WB,IF-F	H
NeuN	#24307	NeuN (D4G4O) XP® Rabbit mAb	WB,IHC,IF-F	H, M, R
	#54761	NeuN (D4G4O) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)	IF-F	H, M, R
	#12943	NeuN (D3S3I) Rabbit mAb	WB,IF-F	H, M, R
Neurofilament-M	#2838	Neurofilament-M (RMO 14.9) Mouse mAb	WB,IP,IHC,IF-F	H, M, R
	#2835	Neurofilament-L (DA2) Mouse mAb	WB,IHC,IF-F	H, M, R
	#2837	Neurofilament-L (C28E10) Rabbit mAb	WB,IHC,IF-F	H, M, R
	#2836	Neurofilament-H (RMdO 20) Mouse mAb	WB,IHC,IF-F	H, M, R
	#8024	Neurofilament-L (C28E10) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)	IF-F	H, M, R
	#8743	Neurofilament-L (C28E10) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 594 Conjugate)	IF-F	H, M, R
	#1005	Neurofilament-L Blocking Peptide
	#9781	Neurofilament Antibody Sampler Kit
Enolase-2	#8171	Enolase-2 (D20H2) Rabbit mAb	WB,IP	H, M, R, Mk
	#9536	Enolase-2 Antibody	WB	H,M
Tau	#46687	Tau (D1M9X) XP® Rabbit mAb	WB,IHC,IF-F,IF-IC	H, M, R
	#4019	Tau (Tau46) Mouse mAb	WB,IF-F,IF-P	H, M, R
	#49561	Phospho-Tau (Thr205) (E7D3E) Rabbit mAb	WB,IP,IF-F,IF-P	H, M, R
	#20194	Phospho-Tau (Ser404) (D2Z4G) Rabbit mAb (IF preferred)	WB,IP,IF-F,IHC	H, M, R
	#12885	Phospho-Tau (Thr181) (D9F4G) Rabbit mAb	WB,IP,IHC-P	H, M, R
	#15013	Phospho-Tau (Ser416) (D7U2P) Rabbit mAb	WB,IP,IHC-P	H, M, R
	#77348	Phospho-Tau (Ser214) (D1Q2X) Rabbit mAb	WB,IP	H, M, R
	#35834	Phospho-Tau (Ser404) (D2Z4G) Rabbit mAb (IHC preferred)	WB,IHC-P	H, M, R
	#29957	Phospho-Tau (Ser199) Antibody	WB	H, M, R
	#39357	Phospho-Tau (Ser202) (D4H7E) Rabbit mAb	WB	H, M, R
	#9632	Phospho-Tau (Ser396) (PHF13) Mouse mAb	WB	M, R
	#57519	FastScan™ Total Tau ELISA Kit		H, M, R
	#90554	FastScan™ Phospho-Tau (Ser416) ELISA Kit		H, M, R
	#96628	Phospho-Tau Family Antibody Sampler Kit
	#56285	PhosphoPlus® Tau (Ser396) Antibody Duet
	#82577	PhosphoPlus® Tau (Ser404) Antibody Duet
	#14511	PhosphoPlus® Tau (Thr181) Antibody Duet
Thy1/CD90	#13801	Thy1/CD90 (D3V8A) Rabbit mAb	WB ,IHC-P	H, M, R
UCHL1	#13179	UCHL1 (D3T2E) XP® Rabbit mAb	WB,IHC-P,IF-IC	H, M, R, Mk
	#11896	UCHL1 (D8R2I) XP® Rabbit mAb	WB,IF-IC	H, M, R, Mk
	#96956	UCHL1 (D3T2E) XP® Rabbit mAb (Biotinylated)	WB	H, M, R, Mk
	#3524	UCHL1 Antibody	WB	H, M, R, Mk
	#12415	SignalSilence® UCHL1 siRNA II		H
	#12353	SignalSilence® UCHL1 siRNA I		H
β3-Tubulin	#5666	β3-Tubulin (D65A4) XP® Rabbit mAb	WB,IP,IHC-P	H, M, R
	#5568	β3-Tubulin (D71G9) XP® Rabbit mAb	WB,IF	H, M, R
	#4466	β3-Tubulin (TU-20) Mouse mAb	WB,IHC,IF-F,	H, M, R

第三，要制备高质量的样本：

1）对于细胞

• 培养细胞的代数年轻
• 细胞没有任何污染
• 细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养
• 细胞的密度一般在 60%-70%

2）对未固定的冰冻切片

• 保持组织的新鲜度
• 选择合适的固定试剂和固定时间

3）对于已经固定的冰冻切片

• 固定时，组织最好是新鲜出炉的

第四，请参考抗体公司给出的实验步骤。

因为 CST 的抗体都是内部严格交叉验证的，每一支抗体的荧光图片（就是上面那些亮瞎眼的图片），都是按照优化的 protocol 做出的。针对每一可以做 IF 的抗体，样本该选用什么样的固定试剂，固定时间，封闭试剂及抗体稀释液和稀释比例等，CST 都一一验证好，实验者严格遵守就好。实验步骤哪里找呢？先打开 www.cst-c.com.cn, 输入相应的抗体货号，以#46687 为例，如下图，点击 IF, 然后展开「实验步骤」，就可以按步骤操作了。