PTM 系列文章（四）

蛋白修饰的检测

我们除了要对蛋白修饰进行检测，还要把蛋白修饰与蛋白功能结合起来进行分析才能真正阐明蛋白修饰对蛋白功能的影响。下面我们介绍一下与蛋白修饰分析有关的常见策略和方法。

1. 对蛋白修饰位点的氨基酸进行点突变

磷酸化修饰常常发生的氨基酸残基包括丝氨酸（Ser，S）、苏氨酸（Thr，T）和酪氨酸（Tyr，Y）。对于氨基酸位点的突变，以氨基酸的结构、空间位阻和电荷的相似性或差异性为基础，一般遵从下列规律：制备功能失活型突变体，常常会把原来的氨基酸残基替换为结构差异比较大的氨基酸残基。例如，会把丝氨酸（Ser，S）和苏氨酸（Thr，T）突变为丙氨酸（Ala，A），而把酪氨酸（Tyr，Y）突变为苯丙氨酸（Phe，F）。在命名和标记上会用原来的氨基酸名称+氨基酸位点数字+突变后的氨基酸名称来表示，如 S312A，代表把某一个蛋白的第 312 位 Ser 突变为 Ala。而制备功能组成型激活突变体，会把 Ser、Thr 或 Tyr 突变为一些酸性氨基酸，如谷氨酸（Glu，E）或天冬氨酸（Asp，D）。

在研究泛素化修饰的时候，大多数都要制备功能失活型突变体，而泛素常常偶联的氨基酸残基是赖氨酸（Lysine，K），按照氨基酸突变的规律，常常会把可能被泛素化的潜在目的蛋白的赖氨酸（Lysine，K）位点突变为精氨酸（Arginine，R）。而在进行多泛素偶联的研究时，会利用泛素表达载体、泛素连接酶表达载体以及被泛素化的潜在目的蛋白表达载体（分别带有不同标签）进行过表达后进行免疫沉淀和免疫印迹分析，这时常常会考虑泛素之间的连接位点，如 K48 位多泛素连接，就会在构建泛素表达载体时，把泛素短肽当中除 K48 位以外的所有其他赖氨酸位点都突变为精氨酸，我们把这种表达载体为泛素化位点特异性表达载体，类似的位点特异性表达载体还有 K63、K11、K27、K29 等不同位点特异性泛素表达载体。当然，也会只单单把泛素短肽当中可能进行多泛素化连接的位点（如 K48、K63、K11、K27、K29 等不同位点）突变为精氨酸（Arginine，R），以干扰在这个位点进行多泛素化连接，这样就可以更清楚某一个位点进行多泛素化连接的作用。这些不同类型的表达载体可以在很多商品化载体供应商（如 Addgene 等）订购到，可以大大节省大家构建的时间。

而在进行类泛素（SUMO）化修饰的研究时，会利用 SUMO 化表达载体、SUMO 化连接酶表达载体以及被 SUMO 化的潜在目的蛋白表达载体进行过表达后进行免疫沉淀和免疫印迹分析。只是 SUMO 化又细分为 SUMO1、SUMO2、SUMO3 和 SUMO4 几种不同的短肽，并且也都分别有带不同标签的商品化表达载体供大家订购使用。

对于多种酰化（含乙酰、琥珀酰、丙二酰等）修饰，因为大多数酰化会偶联在蛋白的赖氨酸位点（Lysine，K），所以制备功能失活型突变体时，也同样会把原来的赖氨酸位点（Lysine，K）突变为精氨酸（Arginine，R）。

对于甲基化修饰，因为甲基化会偶联在蛋白的赖氨酸（Lysine，K）（赖氨酸可偶联单甲基化、二甲基化和三甲基化）或精氨酸（Arginine，R）（精氨酸可偶联单甲基化、对称二甲基化和非对称二甲基化）位点，所以制备功能失活型突变体时，也同样会把原来的赖氨酸位点（Lysine，K）突变为精氨酸（Arginine，R），而把精氨酸（Arginine，R）反而突变为赖氨酸位点（Lysine，K）。

对于糖基化，主要分为连接于天冬酰胺残基（常常位于 Asn–X–Ser/Thr 保守基序中）的酰胺氮原子的 N-糖基化，连接于丝氨酸和苏氨酸残基的羟基氧的 O-糖基化（与磷酸化不能同时发生），连接于磷酸化丝氨酸磷酸基的糖基化，以及相对较少见的连接于色氨酸残基碳的 C-糖基化。在这里我们主要讨论前两种，N-和 O-糖基化。制备功能失活型突变体时，会把 N-糖基化连接的天冬酰胺位点（Asparagine，N）突变为谷氨酰胺（Glutamine，R），而把 O-糖基化连接的丝氨酸（Ser，S）和苏氨酸（Thr，T）突变为丙氨酸（Ala，A）。

对于 ADP-核糖基化（ADP-ribosylation），最初被发现连接于蛋白的一些酸性氨基酸位点，如谷氨酸和天冬氨酸。后来的一系列报道也发现了别的氨基酸位点，丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、磷酸化的丝氨酸等。

大家可以根据前面已经介绍的氨基酸位点的突变规律进行相应突变即可。

2. 修饰相关酶类的干预

任何修饰偶联到蛋白质或从蛋白质上去除，都需要相应的酶类来实现。比如，磷酸化的添加需要激酶的作用，而磷酸化的去除需要磷酸酶的作用。其他的不同类型的修饰，也都有负责特异性添加和去除某种修饰的两大类酶。
 

修饰类型	负责添加修饰的酶	负责去除修饰的酶
磷酸化	激酶（如 Akt，AMPK 等）	磷酸酶（如 PP1、PTEN、SHP 等）
泛素化	E1、E2、E3 系统（E3 连接酶见下面链接）	去泛素化酶（如 OTU1、USP 等家族成员）
SUMO 化	E1、E2、E3 酶系统（如 UBC9，PIAS 等）	去 SUMO 化酶（Ulp、SENP 等）
乙酰化	乙酰化转移酶	去乙酰化酶
甲基化	甲基化转移酶	去甲基化酶
糖基化	寡糖转移酶（如 STT3、OGT 等）	去糖基化酶（如 OGA）
ADP-核糖基化	ADP 核糖基化转移酶（如 ART，Sirtuin2） ADP 核糖基化多聚酶（如 PARP）	ADP 核糖基化水解酶（如 PARG）

 

在进行修饰研究当中，往往都需要对修饰相关酶类进行干预（增强或者抑制）。如果要对一个修饰相关酶类的作用进行增强，通常会使用野生型基因过表达载体，或利用修饰相关酶的特异性激活剂。如果要对一个修饰相关酶类的作用进行抑制，可以使用功能缺失型突变体（比如把某一个激酶的活性中心缺失或部分关键氨基酸进行突变）过表达载体，也可以使用敲减或敲除的方式，或利用酶的特异性抑制剂，在不同情况下使用。

特别是在对某一种修饰进行广泛分析的时候，除了要鉴定出什么蛋白发生了修饰或发生了变化，还需要确定是什么上游的酶导致了这种修饰发生或者变化，而往往有一些参与修饰的酶（比如泛素化转移酶）有多个候选蛋白，这就需要利用一定的高通量方法（比如利用 siRNA 文库进行不同候选基因表达敲减）进行筛查，以确定到底是哪一个具体的酶。

还有一种研究思路，是从修饰酶类的研究作为出发点，先制备相关修饰酶类的敲除动物模型，然后在敲除动物和野生型之间进行蛋白修饰组学分析，就可以定量分析两组之间的存在修饰水平差异的蛋白，这样就很容易进一步对相关蛋白修饰功能进行分析和验证。

3. 修饰相关蛋白功能的分析

利用上述两个方面的材料，就可以对某个蛋白在带有修饰或不带修饰的情况下的各项功能进行分析，常见的分析包括：利用免疫荧光观测蛋白定位的变化、利用免疫功沉淀检测蛋白相互作用的变化、利用 ELISA 检测蛋白活性的变化、蛋白质结构分析等。

还有的情况下，要根据所研究目的蛋白的类型进行更多的检测。比如某一些转录因子的修饰，可能会利用报告基因系统检测某一个修饰对这个转录因子的转录活性的影响，或者利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术来分析修饰前后转录因子对下游基因转录区域的结合水平是否发生变化。

当然，也可以对修饰造成的多种表型进行分析，比如细胞增殖、细胞死亡、细胞迁移、细胞周期、细胞代谢产物水平等等。