太棒了，Western Blot常见 Q&A！看完这个，我也升级当大牛！！！

WB常见问题指南

1、 为什么我的WB实验中没有得到目标蛋白条带？该如何应对？

通过我们长期处理客户技术问题的经验，很多问题都是出在样本制备这一步，抗体出现问题的比例很小。很多时候抗体在其他非CST protocol 下是不工作的——一些小的改变可能会导致结果的巨大变化，做WB和IP的时候，一些抗体对实验条件尤其敏感。我们建议客户首先要确定以下几个基本问题：

a） 目的细胞是否表达这种蛋白，丰度如何？

b） 提取蛋白的细胞裂解液中是否加入蛋白酶抑制剂，防止降解。

c） 是否按照CST建议的操作方法进行实验？

d） 刺激处理是否恰当？

e） 抗体是否有问题，我们提供专门的细胞裂解物来用于检测您的抗体是否存在问题，这是最好和最快捷的方法。

2. 湿转，半干转适用于CST抗体吗？

我们尝试用不同的方法去转膜，但并非每一种方法都尝试过。曾测试过的转膜系统有LifeTechnology’s iBind, Life Technology’s iBlot, Millipore’s SNAPi.d., BioRad’s TransBlot Turbo 。当用不同的转膜系统时，我们建议优化SDS-PAGE凝胶电泳、转膜以及各种条件。通常说来，还是推荐用湿转法。

3. 做磷酸化抗体的时候一定要用脱脂奶粉稀释吗？

一些客户认为在做磷酸化抗体的时候，用脱脂奶粉来封闭会引起比较高的背景，并且喜欢用PBS来作为稀释液，但这些说法是没有科研依据的。CST的技术专家团队推荐用5% 脱脂奶粉，TBS，0.1% Tween^®20，室温下1小时来封闭一抗。

4. 为什么要超声？如果没有超声仪，有什么替代方法？

我们推荐在35%-40%功率下处理10-15s，重复3次，每次间隔时间30s，全程将样品试管置于冰上，可完全裂解细胞以打碎核染色质，减少样品的粘稠度，对于检测膜结合蛋白和核蛋白非常重要。但每个超声仪的最佳设置需单独确定，若成熟可自行决定处理条件。如果没有超声波破碎仪，可选用细的21 G针头抽吸样品来破碎。如果样本太黏稠，可先用 16 或18 G，然后再用21 G。

5. 不同的细胞组分有相应的loading control吗?

可以在网页 http://www.cellsignal.com/catalog/loading-controls.html 找到答案。比如VDAC(D73D12) Rabbit mAb #4661可以作为线粒体内参。CellFractionation Antibody Sampler Kit #11843 就包含几种不同的内参：Histone H3 (D1H2) XP^® Rabbit mAb #4499可以作为核内参；AIF (D39D2) XP^®Rabbit mAb #5318可以作为线粒体内参；Vimentin (D21H3) XP^® Rabbit mAb #5741是细胞骨架的标志物；MEK1/2 (D1A5) Rabbit mAb #8727可以作为细胞质内参。

6. 转膜时，该如何选择膜孔径?对大分子量和小分子量蛋白有哪些需要特别注意的地方？

对所有的蛋白，我们推荐用Nitrocellulose Sandwiches #12369 （0.2um）的杂交膜去转膜，尤其是分子量低于30 KD的蛋白，建议使用较高浓度（12-15%）的蛋白分离胶并缩短转膜的时间，建议在1小时以内。

大分子量蛋白(>150 kDa)推荐使用tris-acetate SDS-PAGE凝胶系统，而不是传统的(tris-glycine)，以及5%的甲醇。因为tris-acetate凝胶是在一个中性pH的条件下，所以分辨率比较高而且迁移的也更加精准。低浓度的甲醇可以使转膜的效率更高 (25 mM Tris base, 0.2 M glycine, 5% methanol)。长时间的转膜(3小时，70 伏)也是很有帮助的。对mTOR来说长时间的转膜可能不一定有效，因为mTOR是个高表达蛋白，一般来说用常规的protocol也可以得到比较好的实验结果，但是对于BRCA1,ATM,ATR等这些大分子量蛋白还是十分有帮助的。

7．WB时，如何选择阳性对照？

CST的科学家制定了一个一些抗体的对照表格，可在网页 http://www.cellsignal.com/support/controls.html 找到答案，但是有些蛋白可能只是在特定模型中或特定的刺激中表达，所以这些蛋白可能没有合适的对照，您可以参考说明书中提供的图片上的细胞系来做对照。

8. 荧光WB和CST推荐的常规WB有什么区别？

区别主要有2点：(1) 在封闭液中不要加入Tween-20； (2) 在曝光之前要保持膜的干燥。一般来说在LI-COR Odyssey^® 和其他的荧光体系下CST的抗体都会有不错的表现，但是并没有用这种方法检测过我们所有的产品，所以恐怕无法保证实验质量。当用荧光WB出现问题的时候，我们建议客户在最亮的通道（通常是DyLight^® 680 Conjugate）下检测并且避免多通道检测。也可参考网页上我们推荐的荧光WB步骤：http://www.cellsignal.com/support/tech_fluorescent_western.html

9. 为什么有些抗体的实际分子量和说明书中的分子量会有所偏差？

原因很多，要根据实际情况加以判断。a) 如果是1~5kD的偏差，都是正常的，因为很多蛋白在不断研究中发现，存在多种蛋白翻译后修饰，如磷酸化、泛素化、糖基化等等，会造成蛋白电泳行为的偏移，从而影响蛋白实际条带的位置；b）如果蛋白被体外的蛋白酶降解，也会出现分子量变小的情况，需要考虑样品制备和保存的问题，防止降解；c）如果出现条带比预期分子量成倍增加，考虑是不是存在多聚体的情况；d）一些蛋白复合体在裂解时没有充分分离，个别情况下会存在条带偏差，如ATG5-ATG12复合体，当使用ATG5的抗体去杂交，就有可能出现ATG5-ATG12复合体的条带；e）所使用的细胞系是否多次传代，因为多次传代的肿瘤细胞，有可能出现蛋白分子量偏移的问题，主要是转录本发生了变化；f）个别情况下，蛋白对应基因发生异位，造成重组蛋白，影响分子量；g）抗体质量问题，特异性受到影响，建议使用我们提供的阳性对照裂解物去查找抗体是否有问题。h）SDS-PAGE 凝胶的成分和跑胶的条件以及marker也都是一些重要的影响因子。

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